L'estratto di lievito è un componente fondamentale in molti terreni di coltura utilizzati in microbiologia. È ricco di nutrienti essenziali che supportano la crescita di una vasta gamma di microrganismi. Visita lo Store Amazon Ufficiale di Microbiologia Italia, in cui troverai alimenti biologici, prodotti per la cura della pelle, strumenti di fitness, integratori ed anche regali per i più piccoli.
Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth
Perché si usa? Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth è un terreno liquido frequentemente utilizzato per la crescita e la propagazione di vari tipi diversi di lievito quando si vuole realizzare una coltura in sospensione.
I lieviti sono microrganismi unicellulari eucarioti ed eterotrofi: necessitano pertanto per crescere di una fonte di carbonio (rappresentata in questo terreno dal D- glucosio o destrosio) e di alcuni amminoacidi che vengono forniti dalla presenza, nella formulazione, sia del peptone che dell’estratto di lievito (quest’ultimo assicura tra l’altro anche la presenza d’importanti precursori nucleotidici per la divisione cellulare e non solo).
E’ quindi un terreno ideale che garantisce di allestire, in breve tempo, una coltura di lieviti che abbia condizioni di crescita ottimali.
Composizione:
- estratto di lievito (10g/L)
- peptone (20g/L)
- D-glucosio (20g/L)
- estratto di malto (30g/L)
- acqua deionizzata (1L)
- pH finale richiesto*: 5.5 ±0.2 a 25°C
(*= Una volta preparato il terreno e prima della sua sterilizzazione finale in autoclave si suggerisce di controllare il pH del terreno tramite pH-metro poiché potrebbe essere necessario aggiustarlo; ciò di solito si effettua tramite titolazione con una soluzione diluita di acido tartarico o con una semplice soluzione di NaOH 0.4 M aggiunta lentamente. I lieviti crescono meglio in un ambiente sufficientemente acido; alcune fonti in letteratura propongono anzi di titolare fino a portare il pH a 4.5 ±0.2 perchè in tali condizioni si scoraggia la crescita di eventuali altri microrganismi contaminanti.)
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Preparazione del terreno:
- Pesare dapprima l’estratto di lievito, quindi l’estratto di malto e trasferirli entrambi in un becher da 1 L.
- Aggiungere 500ml di acqua deionizzata e mescolare con cura fino alla dissoluzione completa (si dovrebbe ottenere una soluzione omogenea e color giallo arancio).
- Pesare ora anche il peptone ed il glucosio ed aggiungere entrambi alla soluzione precedente, mescolando fino alla loro completa dissoluzione.
- Portare a volume di 1L aggiungendo l’acqua deionizzata restante.
- Sterilizzare in autoclave per 15 minuti a 121 °C.
- Conservare il terreno cosi’ ottenuto a temperatura ambiente, ben tappato ed al riparo da fonti di luce e di calore (si consiglia di utilizzarlo entro un paio di mesi al massimo dalla sua preparazione).
Nel Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth non devono essere presenti aggregati particellari: la soluzione ottenuta deve risultare assolutamente limpida ed omogenea (solitamente si ottiene una colorazione tipica e molto brillante che ricorda quella del miele di castagno, arancio rossastra con riverberi dorati).
L’estratto di malto è disponibile commercialmente sia in polvere (come liofilizzato) che come soluzione; a seconda dell’utilizzo dell’una o dell’altra forma per la preparazione del terreno, la colorazione finale dello stesso potrebbe risultare leggermente differente e virare più al giallo (Fig.1) , piuttosto che al vermiglio (Fig.2). In entrambi i casi comunque, ai fini nutrizionali del lievito, l’utilizzo dell’una o dell’altra forma di preparato è indifferente.
Figura 1 - Esempio della possibile colorazione assunta dal terreno al termine della preparazione: specie quando si utilizza un estratto di malto disponibile in forma liquida, l’aspetto potrebbe tendere maggiormente al giallo più che all’arancio.
Figura 2 - Esempio di colorazione finale assunta dal terreno quando si utilizza un estratto di malto in forma solida (polvere) per la sua preparazione.
PYG (Peptone yeast extract-glucose)
Il PYG (Peptone yeast extract-glucose) è un terreno di coltura liquido, non selettivo, utilizzato nella valutazione qualitativa dei prodotti del metabolismo dei batteri anaerobi, nonché delle loro reazioni di fermentazione.
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Come funziona?
I peptoni e l’estratto di lievito forniscono nutrienti ai batteri anaerobi, mentre il glucosio è fonte di energia. Il bicarbonato di sodio e l’idrogenofosfato di potassio hanno invece la funzione di tamponi. La cisteina viene aggiunta per mantenere bassa la quantità di ossigeno, mentre l’emina è utile per stimolare il fattore X, che supporta la crescita dei microrganismi. La vitamina K, infine, aiuta la crescita dei batteri anaerobi, in particolare del genere Bacteroides.
Composizione del terreno:
- Peptoni 20 g
- Glucosio 10 g
- Estratto di lievito 10 g
- Bicarbonato di Sodio 0.4 g
- Idrogenofosfato di Potassio 40 mg
- Fosfato di Potassio 40 mg
- Emina 10 mg
- Vitamina K 10 mg
- L-cisteina idrocloride 8 mg
- Magnesio solfato 8 mg
- Acqua demineralizzata 1000 ml
- pH 7.1 ± 0.3 a 25 °C
Preparazione del terreno:
- Miscelare gli ingredienti ed aggiungere 1000 ml d’acqua
- Mescolare accuratamente
- Riscaldare fino a bollitura
- Versare nei tubi ed autoclavare a 121 °C per 15 minuti.
Risultati della crescita:
| Microrganismo | Incubazione | Crescita |
|---|---|---|
| Bacteroides fragilis | In anaerobiosi; 35-37 °C per 48h | Buona |
| Clostridium prefringens | In anaerobiosi; 35-37 °C per 48h | Buona |
Figura 1 - Flaconi di PYG broth pronto all’uso.
Limitazioni del terreno:
L’identificazione finale dei batteri anaerobi isolati su terreno PYG prevede un’analisi aggiuntiva tramite cromatografia gas-liquido (GLC). Attraverso questa tecnica è possibile individuare il tipo di batterio anaerobio valutando il profilo dei prodotti della fermentazione del glucosio: gli acidi grassi volatili, come l’acido acetico, l’acido propionico e l’acido butirrico e i composti organici non volatili. Generi diversi di batteri producono profili differenti. Dai brodi di coltura si estraggono le cellule batteriche che vengono saponificate per liberare gli acidi grassi, che sono poi sottoposti a cromatografia.
LB media
I terreni colturali più comuni per la crescita di Escherichia coli sono gli LB media (Luria-Bertani). I due principali ingredienti dei terreni LB sono il triptone e l’estratto di lievito. Il triptone si impiega ad una concentrazione di 10 g/l e l’estratto di lievito ad una concentrazione di 5 g/l.
Le varie formulazioni dei terreni LB differiscono per la concentrazione del cloruro di sodio NaCl. Il terreno LB Miller è il terreno High Salt LB Medium con 10 g/l mentre il terreno LB Lennox è il terreno LB Low Salt con 5 g/l. L-Broth contiene solo 0,5 g/l NaCl ed è utilizzato principalmente per lavorare con il phage P1, laddove CaCl2 è aggiunto per un’efficiente aderenza del phage alla cellula.
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Nei terreni LBM Mg2+ è aggiunto per incrementare l’assorbimento di phage lambda alle cellule. Numerosi e differenti tipi di terreni colturali LB presentano sinonimi. Nel caso in cui non riusciate a trovare un terreno, provate a cercarlo con il sinonimo.
Tryptone Broth è un terreno moderatamente ricco per la crescita e la coltivazione di Escherichia coli . Terrific Broth è un terreno più ricco rispetto ai terreni LB e Tryptone media. Il terreno è stato ideato per una pià alta densità di crescita di cellule di Escherichia coli ed una più elevata raccolta di DNA plasmidico rispetto ad LB a Tryptone Broth.
Super Broth è un terreno ancora più ricco ideato per ottenere elevati raccolti di bacteriophage lambda nei lisati liquidi.
Raccomandazioni generali per la preparazione dei terreni:
- dovrà essere accuratamente richiuso.
- temperatura ambiente in un luogo asciutto.
- della quantità di acqua occorrente.
- che sia distillata o deionizzata.
- dissolta.
- importante è che sia lento.
- regolarità la miscela.
- miscela in preparazione.
- prima della sterilizzazione in autoclave.
- raggiunge i 98-100°C.
- agitandola con energia.
- sempre mantenendo la miscela in agitazione.
- miscela.
- 121°C per 15 minuti (15 psi ).
- zuccheri.
- proteine.
- cellule dei microrganismi.
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