Gli aminoacil-tRNA sintetasi (ARSs) catalizzano l'attacco di ciascun amminoacido al proprio tRNA affine. Gli ARSs mitocondriali (mtARSs), che assicurano la sintesi proteica all'interno del compartimento mitocondriale, sono codificati da geni nucleari e importati nell'organello dopo la traduzione nel citosol.
Ad oggi, grazie all'uso estensivo del sequenziamento di nuova generazione (NGS), è stato identificato un numero crescente di varianti nei geni mtARS e associato a malattie mitocondriali. Le somiglianze tra i macchinari di traduzione mitocondriale di lievito e umani rendono il lievito un buon modello per valutare l'effetto delle varianti nei geni mtARS in modo rapido ed efficiente.
Il vaglio genetico di pazienti con sospetto clinico di disturbi mitocondriali attraverso un pannello genico personalizzato di geni noti per la malattia, compresi tutti i geni che codificano mtARSs, ha portato all'identificazione di varianti missenso in WARS2, NARS2 e RARS2. La maggior parte di essi sono stati classificati come Varianti di Significato Incerto.
Abbiamo sfruttato modelli di lievito per valutare le conseguenze funzionali delle varianti riscontrate in questi geni che codificano per la triptofanil-tRNA, l'asparaginil-tRNA e l'arginil-tRNA sintetasi mitocondriali, rispettivamente. Fenotipi mitocondriali come la crescita ossidativa, il tasso di consumo di ossigeno, il livello di stato stazionario di Cox2 e la sintesi proteica mitocondriale sono stati analizzati in ceppi di lievito deleteri in MSW1, SLM5 e MSR1 (gli ortologhi di lievito di WARS2, NARS2 e RARS2, rispettivamente) ed esprimono l'allele wild type o mutante.
La patogenicità è stata confermata per la maggior parte delle varianti, portando alla loro riclassificazione come Probabilmente Patogeniche.
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Abbiamo recentemente costruito due nuovi modelli di lievito per valutare le conseguenze funzionali di nuove mutazioni riscontrate in NARS2 e WARS2, che codificano rispettivamente l'asparaginil-tRNA (AsnRS) e la triptofanil-tRNA sintetasi (TrpRS) mitocondriali.
Sono stati analizzati fenotipi mitocondriali come la crescita ossidativa, il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il livello proteico di Cox2 in ceppi di lievito deleteri in SLM5 e MSW1, gli ortologhi di lievito di NARS2 e WARS2, ed esprimono gli alleli wild type o mutanti sia individualmente che in combinazione, confermando la patogenicità della maggior parte delle varianti identificate.
Inoltre, nel modello di lievito NARS2 sono stati studiati gli effetti benefici derivanti dall'integrazione di asparagina nel terreno di crescita.
Abbiamo identificato varianti missenso eterozigoti composte di WARS2 in un bambino con paraparesi spastica, tremore e atassia e in un altro con parkinsonismo infantile, mentre varianti missenso eterozigoti composte di NARS2 sono state riscontrate in un bambino con ritardo dello sviluppo, epilessia e deficit del complesso I.
Le mutazioni dei geni tRNA mitocondriali (mt) sono un'importante causa di morbilità umana e sono associate a diverse sindromi. Abbiamo precedentemente dimostrato che il fattore di allungamento della sintesi proteica mitocondriale EF-Tu e sequenze isolate dal dominio carbossi-terminale delle leucil-tRNA sintetasi (LeuRS) mt di lievito e umane, hanno un'ampia gamma di capacità di soppressione tra diversi mutanti tRNA mt di lievito aventi un fenotipo respiratorio difettoso.
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Qui mostriamo che la capacità di salvataggio può essere limitata a una sequenza specifica di sei amminoacidi dal dominio carbossi-terminale di mt LeuRS. D'altra parte, sovraesprimendo una versione mutata di mt EF-Tu in un ceppo di lievito deleto per il gene nucleare endogeno, abbiamo identificato la regione specifica coinvolta nella soppressione.
I risultati supportano la possibilità che un piccolo peptide possa correggere i difetti associati a molte mutazioni di mt tRNA, suggerendo una nuova terapia per il trattamento delle malattie mitocondriali.
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