Scopri i Segreti dei Terreni di Coltura per Lieviti: Composizione Perfetta e Preparazione Facile!

I lieviti sono microrganismi unicellulari eucarioti ed eterotrofi: necessitano pertanto per crescere di una fonte di carbonio e di alcuni amminoacidi.

Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth

Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth è un terreno liquido frequentemente utilizzato per la crescita e la propagazione di vari tipi diversi di lievito quando si vuole realizzare una coltura in sospensione.

E’ quindi un terreno ideale che garantisce di allestire, in breve tempo, una coltura di lieviti che abbia condizioni di crescita ottimali.

Nel Yeast Extract-Peptone-Dextrose Broth non devono essere presenti aggregati particellari: la soluzione ottenuta deve risultare assolutamente limpida ed omogenea (solitamente si ottiene una colorazione tipica e molto brillante che ricorda quella del miele di castagno, arancio rossastra con riverberi dorati).

I lieviti crescono meglio in un ambiente sufficientemente acido; alcune fonti in letteratura propongono anzi di titolare fino a portare il pH a 4.5 ±0.2 perchè in tali condizioni si scoraggia la crescita di eventuali altri microrganismi contaminanti.

Composizione del terreno

La composizione del terreno è la seguente:

estratto di lievito (10g/L)
peptone (20g/L)
D-glucosio (20g/L)
estratto di malto (30g/L)
acqua deionizzata (1L)

pH finale richiesto*: 5.5 ±0.2 a 25°C

(* = Una volta preparato il terreno e prima della sua sterilizzazione finale in autoclave si suggerisce di controllare il pH del terreno tramite pH-metro poiché potrebbe essere necessario aggiustarlo; ciò di solito si effettua tramite titolazione con una soluzione diluita di acido tartarico o con una semplice soluzione di NaOH 0.4 M aggiunta lentamente.

L’estratto di malto è disponibile commercialmente sia in polvere (come liofilizzato) che come soluzione; a seconda dell’utilizzo dell’una o dell’altra forma per la preparazione del terreno, la colorazione finale dello stesso potrebbe risultare leggermente differente e virare più al giallo (Fig.1) , piuttosto che al vermiglio (Fig.2). In entrambi i casi comunque, ai fini nutrizionali del lievito, l’utilizzo dell’una o dell’altra forma di preparato è indifferente.

Preparazione del terreno

Pesare dapprima l’estratto di lievito, quindi l’estratto di malto e trasferirli entrambi in un becher da 1 L;
Aggiungere 500ml di acqua deionizzata e mescolare con cura fino alla dissoluzione completa (si dovrebbe ottenere una soluzione omogenea e color giallo arancio);
Pesare ora anche il peptone ed il glucosio ed aggiungere entrambi alla soluzione precedente, mescolando fino alla loro completa dissoluzione;
Portare a volume di 1L aggiungendo l’acqua deionizzata restante.
Sterilizzare in autoclave per 15 minuti a 121 °C;
Conservare il terreno cosi’ ottenuto a temperatura ambiente, ben tappato ed al riparo da fonti di luce e di calore (si consiglia di utilizzarlo entro un paio di mesi al massimo dalla sua preparazione).

DRBC (Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol) Agar

DRBC (Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol) Agar è un terreno di coltura selettivo impiegato per il conteggio dei lieviti e delle muffe negli alimenti e nei mangimi, con un’attività dell’acqua o acqua libera superiore a 0,95 (aw>0,95).

Leggi anche: Caratteristiche dei Lieviti Apiculati

Attività dell’acqua o acqua libera (aw): è la quantità di acqua libera, non legata chimicamente, presente in un alimento.

Questo terreno è ora raccomandato dalla norma ISO 21527-1 per l’enumerazione di lieviti e muffe nei prodotti destinati al consumo umano ed all’alimentazione animale, aventi un’attività dell’acqua superiore a 0,95 (es. uova, carne, prodotti lattiero-caseari fatta eccezione per il latte in polvere, frutta, verdura, paste fresche).

DRBC Agar è inoltre previsto dal FDA-BAM per l’analisi di campioni contenenti muffe “invasive” (ad esempio, Mucor, Rhizopus, ecc.).

Per il conteggio dei lieviti e delle muffe negli alimenti con aw ≤ 0,95 si utilizza il terreno DG18 Agar, in accordo alla norma ISO 21527-2 ed a FDA-BAM.

I lieviti e le muffe ritrovabili negli alimenti comprendono più di un centinaio di specie, estremamente versatili nei requisiti ambientali per la sopravvivenza e la crescita.

I funghi possono invadere e crescere virtualmente su qualsiasi tipo di alimento, in qualsiasi momento, causandone vari gradi di deterioramento.

L’alimento contaminato può essere leggermente o gravemente alterato o completamente decomposto. La loro presenza si manifestata con macchie di varie dimensioni e, occasionalmente, un alimento può apparire privo di muffe, ma all’esame micologico risultare contaminato.

Diverse muffe e forse anche lieviti presenti negli alimenti possono essere pericolosi per la salute umana o animale a causa della loro capacità di produrre metaboliti tossici noti come micotossine.

Un po’ di storia

Lo sviluppo dei terreni di coltura per l’isolamento e l’enumerazione dei lieviti e delle muffe negli alimenti si è perfezionato sempre più nel tempo.

I primi terreni selettivi erano acidificati per sopprimere la crescita batterica e tra questi, il Malt Extract Agar, il Malt Agar ed il Potato Dextrose Agar acidificati sono usati ancora oggi per specifici campioni.

In seguito, l’aggiunta di antibiotici a terreni con un pH più elevato ha permesso la crescita di una gamma più ampia di funghi ed un miglioramento nel recupero delle spore fungine stressate sub-letalmente.

Un ulteriore miglioramento si ottenne con l’impiego del rosa bengala per contenere la diffusione delle colonie di muffe sulla piastra e Jarvis nel 1973 propose il Rose-Bengal-Chloramphenicol (RBC) Agar.

King, Hocking e Pitt nel 1979 idearono il DRBC Agar, combinando il dicloran al rosa bengala per meglio limitare lo sviluppo aereo miceliare delle muffe ed il diametro delle loro colonie.

Composizione del terreno DRBC Agar

DRBC Agar, formula per litro (ISO 21527-1):

Digerito enzimatico di tessuti animali e vegetali: 5 g
D-Glucosio: 10 g
Potassio diidrogenofosfato: 1 g
Magnesio solfato idrato: 0,5 g
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina): 0,002 g
Rosa bengala: 0,025 g
Cloramfenicolo: 0,1 g*
Agar: 12-15 g

*Il cloramfenicolo non è presente in alcuni terreni in polvere del commercio e deve quindi essere aggiunto separatamente (vedi preparazione del terreno)

pH finale (20-25°C): 5,6 ± 0,2

Come funziona il DRBC Agar?

Il digerito enzimatico di tessuti animali e vegetali fornisce azoto, carbonio e minerali per la crescita microbica.

Il glucosio è una fonte di carbonio ed energia.

Il potassio diidrogenofosfato tampona il terreno ed il solfato di magnesio favorisce la crescita fungina.

La combinazione di dicloran e rosa bengala, a pH 5,6, oltre ad avere un’attività antibatterica, limita lo sviluppo aereo dei miceli ed il diametro delle colonie delle muffe.

Questa caratteristica restrittiva rende il terreno di coltura particolarmente adatto per l’enumerazione, in quanto consente la crescita non oscurata di funghi che normalmente formano piccole colonie.

Il cloramfenicolo è un antibiotico ad ampio spettro che sopprima la crescita di un’ampia gamma di batteri Gram-negativi e Gram-positivi.

Preparazione del terreno DRBC Agar

Trasferire in un matraccio tra 28,6 e 31,6 g di terreno in polvere, in funzione della quantità di agar presente nella formulazione disponibile commercialmente.
Aggiungere 1000 ml di acqua purificata e mescolare con cura.
Portare ad ebollizione agitando frequentemente per sciogliere completamente la polvere.
Nel caso si utilizzasse un terreno in polvere privo di cloramfenicolo, addizionare 10 ml di una soluzione al 1% in etanolo di cloramfenicolo, oppure il supplemento selettivo liofilizzato disponibile commercialmente, ricostituito secondo le indicazioni del produttore.
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti.
Raffreddare a 44-50°C, mescolare bene e distribuire in aliquote da 15 mL in piastre di Petri sterili.
Evitare l’esposizione del terreno alla luce.

Metodo di semina del DRBC Agar

La procedura qui descritta è una sintesi del metodo descritto dalla norma ISO 21527-1 per i prodotti destinati al consumo umano ed alla alimentazione animale.

Considerando la natura aerobica dei lieviti e delle muffe, la semina in superficie è preferibile a quella per inclusione.

Su una piastra di DRBC Agar, utilizzando una pipetta sterile, trasferire 0,1 ml del campione in esame se liquido o 0,1 ml della sospensione iniziale nel caso di altri prodotti.
Per facilitare il conteggio di cariche fungine basse, distribuire 0,3 mL del campione o 0,3 ml della sospensione iniziale su tre piastre o su una piastra di diametro 140 mm.
Ripetere questa operazione con le diluizioni successive, utilizzando una nuova pipetta sterile per ogni diluizione decimale.
Distribuire uniformemente il liquido sulla superficie dell’agar con un dispositivo sterile fino a completo assorbimento dell’inoculo nel terreno.
Incubare in aerobiosi a 25 ± 1°C per 5 giorni, con il coperchio rivolto verso l’alto.

Attenzioni

È possibile aggiungere al diluente per la preparazione del campione (es acqua peptonata 0,1%) agenti tensioattivi, come il Tween 80 (0,05 %), per ridurre l’aggregazione delle spore e dei conidi.
Si raccomanda di incubare le piastre in un sacchetto di plastica aperto per non contaminare l’incubatore in caso di diffusione delle muffe fuori dalle piastre.
Le spore delle muffe si disperdono nell’aria con grande facilità, maneggiare le piastre di Petri con cura per proteggere l’operatore e per evitare lo sviluppo di colonie satellite che darebbero una sovrastima della popolazione nel campione.

Risultati della crescita su DRBC Agar

Leggere le piastre tra il secondo ed il quinto giorno di incubazione e contare le colonie nelle piastre contenenti meno di 150 colonie.

Se le muffe a crescita rapida rappresentassero un problema, contare le colonie dopo 2 giorni e di nuovo dopo 5 giorni di incubazione.

Se necessario, effettuare un esame delle colonie con una lente d’ingrandimento binoculare o con un microscopio al fine di distinguere le cellule dei lieviti o delle muffe dai batteri e, se richiesto, contare separatamente le colonie di lieviti e le colonie di muffe.

Per l’identificazione, selezionare le aree di crescita fungina e rimuoverle per un esame microscopico ad elevato ingrandimento o per inoculare gli appropriati terreni di isolamento o di identificazione.

Riportare i risultati come numero di colonie per grammo o millilitro di campione.

Controllo qualità del DRBC Agar

I terreni disponibili commercialmente sono sottoposti a rigorosi controlli di qualità per verificarne la conformità alle specifiche.

L’utilizzatore può comunque eseguire il proprio controllo di qualità sulle piastre preparate in laboratorio, in funzione dei requisiti regolamentari e delle norme di accreditamento.

ISO 11133 suggerisce i seguenti ceppi, avendo come riferimento il Sabouraud Dextrose Agar per calcolare l’indice di produttività (PR:UFC su DRBC Agar/UFC su SDA):

Ceppo	Tipo di test	Inoculo	Risultati attesi
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Candida albicans ATCC 10231	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Mucor racemosus ATCC 42647	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Escherichia coli ATCC 25922	Qualitativo	104 - 106 UFC/piastra	Nessuna crescita

Incubazione: 25°± 1°C, 5 giorni, aerobiosi

*colonie caratteristiche in funzione della specie

Limitazioni all’utilizzo del terreno DRBC Agar

Evitare l’esposizione del terreno alla luce, poiché i prodotti di decomposizione citotossica possono determinare una sottostima della microflora nei campioni.
Il metodo qui descritto non è adatto per l’enumerazione delle spore fungine e dei funghi resistenti al calore, come Byssochlamys fulva o Byssochlamys nivea.
Secondo la norma ISO 21527-1, quando per determinati campioni (es. carne cruda) la sovra-crescita batterica può costituire un problema, si può impiegare una associazione di cloramfenicolo 50 mg/L e cloratetraciclina HCl 50 mg/L. In questo caso utilizzare un terreno in polvere privo di cloramfenicolo ed addizionare le appropriate soluzioni dei due antibiotici.
Per evitare la sovra-crescita di Mucoraceae sulle piastre, ISO 21527-1 raccomanda l’aggiunta di Tergitol (1 ml/l) al terreno di coltura.
I metodi di conteggio dei lieviti e soprattutto delle muffe sono imprecisi e spesso non è rispettata la linearità nel numero di UFC in diluizioni diverse, perché essi sono costituiti da una miscela di micelio e spore asessuate e sessuate. Il numero di unità formanti colonie dipende dal grado di frammentazione del micelio e dalla proporzione di spore in grado di crescere sul terreno in piastra.

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Terreni di Coltura per Lieviti: Composizione e Preparazione